Ernst-Jan Eggers1,2, Ate van der Burgt1, Sjaak AW van Heusden2, Michiel E. de Vries@ 1, Richard GF Visser ©2, Christian WB Bachem©2и & Pim Lindhout1
Genetiese wins in aartappel word belemmer deur die heterosigotiese tetraploïede genoom van gekweekte aartappel. Die omskakeling van aartappels in 'n diploïede ingeteelde lyn-gebaseerde F1-bastergewas bied 'n belowende roete na verhoogde genetiese wins. Die bekendstelling van 'n dominante S-lokus inhibeerder (Sli) geen in diploïede aartappel kiemplasma laat doeltreffende generering van selfbevrugte sade en dus die ontwikkeling van aartappel ingeteelde lyne toe. Min is bekend oor die struktuur en funksie van die Sli-lokus. Hier beskryf ons die kartering van Sli tot 'n 12.6 kb interval op chromosoom 12 deur 'n rekombinante skerm benadering te gebruik. Een van twee kandidaatgene wat in hierdie interval teenwoordig is, toon 'n unieke volgorde wat uitsluitlik teenwoordig is in selfversoenbare lyne. Ons beskryf 'n uitdrukkingsvektor wat self-onversoenbaar omskakel genotipes in self-versoenbaar en 'n CRISPR-Cas9 vektor wat SC genotipes omskakel na SI. Die Sli-geen kodeer vir 'n F-boks-proteïen wat spesifiek in stuifmeel van selfversoenbare plante uitgedruk word. 'n Invoeging van 533 bp in die promotor van daardie geen lei tot 'n toename in funksiemutasie, wat selfstuifmeelverwerping oorkom.
Aartappel is die belangrikste nie-graan voedselgewas in die wêreld. Maar terwyl ander voedselgewasse soos mielies, rys en koring 'n genetiese opbrengs van 1% per jaar getoon het.1, genetiese wins in aartappel was minimaal2. Tans is die meeste kommersieel verboude aartappelkultivars afkomstig van kruisings tussen heterosigotiese outotetraploïede ouers. In hierdie teelstelsel word honderde duisende saailinge in elke teelgenerasie gegenereer en gekeur om daardie seldsame individue te identifiseer wat aanvaarbare eienskappe het vir talle eienskappe wat in die nageslag skei. Aangesien daar sowat vyftig eienskappe is wat relevant is vir die waarde van 'n kommersiële aartappelkultivar, is die kans om die beste allele te kombineer wat hierdie eienskappe beheer deur gebruik te maak van konvensionele aartappelteling, gering. Daarbenewens is doelgerigte bekendstelling van nuwe eienskappe in elite kultivars, terwyl die genetiese integriteit deur middel van terugkruisingskemas behou word, onmoontlik sonder homosigotiese ouerlyne. Om hierdie probleme te oorkom, het verskeie groepe ingeteelde-lyngebaseerde diploïede aartappelteelprogramme begin2-5. In hierdie programme word genetiese winste verkry deur inkrementele verbeterings van ouerlyne deur voortdurend te selekteer teen skadelike allele tydens inteling en deur voordelige allele in ingeteelde lyne te stapel deur terugkruisingskemas6. Ouerlike ingeteelde lyne word dan gekruis om heterotiese F1-hibriede nageslag te produseer.
In die meeste diploïede aartappelgenotipes word inteling ernstig beperk deur 'n gametofitiese self-onversoenbaarheid (GSI) sisteem wat deur die multi-alleliese S-lokus beheer word. Hierdie S-lokus kodeer styluitgedrukte S-RNases wat selfstuifmeelbuisgroei in die styl inhibeer, wat selfbevrugting voorkom7. Tydens kruisbestuiwing herken stuifmeel-uitgedrukte S-lokus F-boks proteïene (SLF) S-RNases en rig hulle op die proteasomale degradasie pad, wat stuifmeelbuisgroei na die eierstokke toelaat waar bevrugting kan plaasvind8. Elke S-alleel kodeer 'n S-RNase en veelvuldige SLF'e met verskillende spesifisiteite, wat saam alle S-RNases kan herken behalwe die S-RNase wat op dieselfde alleel teenwoordig is9.
Alhoewel die meeste diploïede aartappellyne selfonversoenbaar (SI) is, bestaan daar wel selfversoenbare diploïede aartappellyne en kan dit gebruik word om selfversoenbaarheid in diploïede aartappelteelprogramme in te voer10-12. Hosaka en Hanneman het 'n dominante S-lokus inhibeerder gekarteer (Sli) geen van a Solanum chacoense toetreding aan die distale punt van chromosoom 12 en dit gebruik om aartappel ingeteelde lyne te genereer13"14. Op grond van hul resultate het Hosaka en Hanneman dit voorgestel SLI is 'n stuifmeel-uitgedrukte geen met sporofitiese werking en wat homosigositeit vir SLI is dodelik sedert homosigoties SliSli genotipes was afwesig in die F8-populasie van S. chacoense. Ons het een van hierdie S gebruik. chacoense (DS)-afgeleide ingeteelde lyne om selfversoenbaarheid in S. tuberosum agtergronde. Hier beskryf ons die identifikasie van die oorsaaklike geen van selfversoenbaarheid om verdere insig te verkry in die biologie van selfversoenbaarheid in diploïede aartappels.
Resultate en bespreking
In een F2 bevolking afgelei van 'n kruising tussen die SLI skenker (aangewys DS) en 'n diploïede S. tuberosum (D2) ons het 'n beskeie effek QTL vir selfbessie-set op chromosoom 2 waargeneem, maar 'n daaropvolgende rekombinante sifting was nie suksesvol nie. Ons het opgemerk dat veelvuldige F2-populasies uiterste skeefheid rondom die lang arm van chromosoom 12 getoon het, met homosigositeit vir die nie-DS-haplotipe wat heeltemal afwesig was.
Op grond van hierdie skeefheid en die kartering van SLI op chromosoom 12 het ons dit veronderstel SLI word gametofities uitgedruk, wat beteken dat in 'n selfbestuiwing van 'n plant heterosigoties vir SLI (Sli/sli), slegs stuifmeel wat die dominant bevat SLI alleel kan deelneem aan selfbevrugting. Om hierdie hipotese te toets, het ons 'n kragtige en hoogs selfvrugbare lyn (16HP1-66) oorgesteek na 'n kragtige selfonversoenbare lyn (D16), die hele genoom volgorde van beide, en die resulterende F1-populasie ontleed (17SC11, n = 251, afb. 1a, b). Aangesien hierdie F1-populasie hoogs polimorf is vir baie lokusse, het ons 'n wye reeks fenotipes waargeneem, insluitend dié wat met vrugbaarheid verband hou. Daarom het ons 'n baie streng en streng fenotiperingsprotokol geïmplementeer wat bessie- en saadset van beide kruis- en selfbestuiwing insluit, asook visualisering van stuifmeelbuisgroei in style om kwessies van steriliteit wat die verenigbaarheidsfenotipe verwar, te vermy. Plante wat meer as een selfbessie stel, word as SC beskou, terwyl plante wat nie selfbessies set na ten minste 10 selfbestuiwings nie, selfstuifmeelbuisgroei stop in die styl toon, en kruisbessies na bestuiwing met grootmaat toon. stuifmeel word as SI beskou. Gevolglik is 'n beduidende deel van die populasie uitgesluit van genetiese ontledings aangesien daar nie aan die vereistes voldoen is om die verenigbaarheidsfenotipe ondubbelsinnig te assesseer nie. Tog kon die verenigbaarheidstatus van die meerderheid van die populasie 17SC11-nageslag beoordeel word en dit is getoon om te skei vir selfversoenbaarheid (Aanvullende Data 1). Aangesien selfversoenbaarheid vanaf 16HP1-66 ontstaan het, het ons die hele genoomvolgorde van hierdie genotipe gebruik om KASP-merkers te ontwerp wat SNP's op chromosome 2 en 12 gerig wat heterosigoties is in 16HP1-66 maar homosigoties in D16, wat die kartering van SLI in die maternale meiose. Ons het 'n genetiese kaart saamgestel, QTL-analise uitgevoer en 'n hoogs betekenisvolle QTL (LOD = 75.72) op die lang arm van chromosoom 12 gevind (Fig. 1b), wat die resultate van Hosaka en Hanneman bevestig.
Om die QTL in 'n ander genetiese agtergrond te bevestig, het ons 'n ander hoogs selfvrugbare genotipe gekruis wat afkomstig is van die Solynta-teelprogram met SI genotipe D14 en die resulterende F1-populasie (17SC25, Aanvullende Data 1) ontleed. Onder 32 individue van bevolking 17SC25, het ons geen SI individue gevind nie. Om 'n segregerende populasie te genereer, het ons die mees vrugbare genotipe gekies en dit gekruis na twee SI genotipes wat ons in populasie 17SC11 geïdentifiseer het, wat gelei het tot populasies 18SC11 en 18SC12 (Aanvullende Data 1 en Aanvullende Fig. 1). Soos verwag, het ontleding van populasies 18SC11 en 18SC12 getoon dat beide populasies skei vir selfversoenbaarheid. Ons het die moeder (17SC25-8) vir heelgenoomvolgordebepaling ingedien en hierdie data gebruik om nuwe KASP-merkers te ontwerp deur dieselfde benadering te gebruik as wat vir populasie 17SC11 gebruik is, maar hierdie keer slegs chromosoom 12 teiken. Daaropvolgende QTL-analise het die QTL wat ons in populasie gevind het, bevestig 17SC11 met LOD-waardes van 33.14 en 120.94 in populasies 18SC11 en 18SC12 onderskeidelik (Aanvullende Fig. 2).
Om te bepaal of SLI word inderdaad gametofities uitgedruk, het ons 'n F2-populasie ontleed (19SC1, n = 160) afgelei van 'n vrugbare en lewenskragtige 17SC11 individu. Blom en vrugbaarheid in hierdie populasie is verminder in vergelyking met die F1. In die fenotipiese analise, uit 160 plante, was 81 plante self-versoenbaar, 78 is gekategoriseer as nie bepaal nie (ND) as gevolg van swak blom of swak vrugbaarheid en een plant is self-onversoenbaar beoordeel (Aanvullende Data 1). Ons het KASP-merkers ontwerp gerig op SNP's op chromosoom 12 wat homosigoties is vir alternatiewe allele in ouers 16HP1-66 en D16. Langs die hele chromosoom 12 wyk segregasieverhoudings aansienlik af van die verwagte 1:2:1 segregasie. Verder, rondom die selfversoenbaarheid QTL, is daar geen loci homosigoties vir die haplotipe van ouer D16 (Aanvullende Fig. 3), wat eerder 'n 1:1 segregasie toon vir heterosigotiese D16/16HP1-66: homosigotiese 16HP1-66, wat daarop dui dat die eliminasie van stuifmeel ontbreek SLI veroorsaak segregasievervorming. Dit ondersteun die hipotese dat slegs stuifmeel die dominante dra SLI alleel neem deel aan selfbevrugting. Daarbenewens, afgesien van een individu, was die fenotipering afdoende vir die kontras tussen SI en SC, wat toon dat die gebruikte fenotipering protokol robuust en byna foutvry is.
Terwyl die 628 KB SLI interval op chromosoom 12 wat die Sli-alleel van populasie 17SC11 dra, is verminder tot 'n kleiner oorvleuelende interval van 169 KB in populasie 18SC12, hierdie intervalle was steeds te groot om die Sli-geen te identifiseer. Daarom het ons daarop gemik om die S/i-bevattende interval te verminder deur 'n rekombinante siftingsbenadering. Om plante te identifiseer met 'n rekombinasie in die SLI interval, het ons 1374 17SC11 saailinge gegenotipeer met twee KASP merkers op die proksimale grens en twee op die distale grens. Ons het 81 saailinge met rekombinasie tussen die twee buitenste merkers geïdentifiseer en dié geselekteer vir verdere fyn kartering. Om ondubbelsinnige fenotipes te kry, het ons hierdie genotipes vegetatief gepropageer en die fenotipering op ten minste twee klone per genotipe uitgevoer. Ons het die 81 rekombinante met meer merkers in die interval gegentipeer en twee insiggewende rekombinante geïdentifiseer wat die interval verminder het tot 27.37 KB wat vyf geannoteerde gene bevat (Aanvullende Data 1).
Om die interval verder te verminder, het ons nog 10165 27.37 saailinge van dieselfde populasie gesif met vier merkers rondom hierdie 12 KB interval en 14 rekombinante geïdentifiseer. Hierdie is verder genotipeer met nog 27.37 merkers in hierdie interval en ons het ses insiggewende rekombinante geïdentifiseer wat duidelike verenigbaarheidsfenotipes getoon het. Twee rekombinante met 'n SC-fenotipe en een met 'n SI-fenotipe het die distale grens van die 12.6 KB-interval bevestig, terwyl drie rekombinante met 'n SI-fenotipe 'n nuwe proksimale grens gedefinieer het wat die interval verminder na slegs 0003 kb wat twee gene bevat, PG400016861GSC0003DM400016860GXNUMXDMXNUMXGXNUMXDMXNUMXGSCXNUMXDMXNUMXGSCXNUMXDMXNUMXGXNUMXSCXNUMXDMXNUMXGSCXNUMXDMXNUMX Fig. 1c).
Om die kandidaatgeen te identifiseer wat verantwoordelik is vir die selfversoenbare fenotipe, het ons die volgordevariasie vir hierdie twee gene in verskeie heel-genoom-volgorde-diploïede aartappellyne ontleed (Aanvullende Data 2). Deur hierdie volgordevariasie met die SC/SI-fenotipes van hierdie lyne te vergelyk, het ons alle SC-spesifieke SNP's en INDELS (Aanvullende Data 2) geïdentifiseer. Vervolgens het ons alle nie-sinonieme SNP's met die hand geïdentifiseer en vasgestel of die aminosuurvervangings algemeen of uniek is vir soortgelyke proteïene in die Solanaceae. Kandidaatgeen PGSC0003DMG400016861 toon ses SC-spesifieke aminosuursubstitusies en veral 'n 533 bp invoeging geleë by -108 bp vanaf die beginkodon, wat daarop dui dat die SC alleel uitdrukking verander het in vergelyking met die SI alleel. Op grond van hierdie genetiese studies het ons veronderstel dat PGSC0003DMG400016861 die SLI geen.
Om die hipotese te verifieer dat Sli in stuifmeel uitgedruk word, het ons stuifmeel van 10 SI en 10 SC aartappelgenotipes in vitro ontkiem en RNA onttrek vir RNA-volgordebepaling. Van die twee oorblywende kandidaatgene is slegs kandidaatgeen PGSC0003DMG400016861 uitgedruk, maar uitsluitlik in stuifmeel van SC genotipes (Fig. 2a). Verder, in plante heterosigoties vir die vermeende kandidaat Sli geen, is slegs die Sli alleel uitgedruk. Interessant genoeg het ander stuifmeel-uitgedrukte gene wat naby die Sli-lokus op Chromosoom 12 geleë is, soortgelyke uitdrukkingsvlakke in SC- en SI-plante getoon (Fig. 2a). Daarom het ons tot die gevolgtrekking gekom dat slegs die PGSC0003DMG400016861-geen spesifiek in stuifmeelbuise van SC-plante uitgedruk word.
Om die oorsprong van die 533 bp invoeging te ondersoek, het ons 'n BLAST soektog van die 533 bp volgorde op NCBI uitgevoer. Interessant genoeg is rye wat merkwaardig soortgelyk is aan die Sli-spesifieke invoeging algemeen in opeenvolgende S. tuberosum toetredings (Fig. 2b). Verder het die 533 bp-invoeging 'n homologie met 'n volgorde in S. pennellii. Gebruik die volgorde van S. pennellii as 'n BLAST-navraag het ons soortgelyke rye in S gevind. lycopersicum. Filogenetiese analise van die rye in S. tuberosum, S. pennellii en S. lycopersicum groepe die S. pennellii volgorde saam met die S. lycopersicum en een S. tuberosum volgorde, wat daarop dui dat hierdie 'n gemeenskaplike oorsprong deel (Aanvullende Fig. 4a). Ons het veronderstel dat die invoeging van 'n transponeerbare element (TE) afgelei is. Ons het 'n kolletjie-grafiek van die 533 bp-reeks gegenereer en waargeneem dat die reeks miniatuur omgekeerde herhalings bevat (Aanvullende Fig. 4b). Ons het die 533 bp-invoeging na BLAST teen die plant MITE-databasis ingedien, wat gelei het tot veelvuldige treffers van MITE-familie DTA_Sot42 in S. tuberosum15, wat aandui dat die 533 bp invoeging in die promotor van SLI kom inderdaad van 'n TE af (Aanvullende Fig. 4c).
Om verder te bevestig dat PGSC0003DMG400016861 inderdaad is SLI, het ons 'n uitdrukkingskonstruksie ontwerp wat die eksons van die SC-alleel van bevat SLI tussen sy inheemse promotor en terminator (Fig. 3a) in vektor pBINPLUS (pBINPLUS-Sli). Ons het hierdie konstruk gebruik om twee SI genotipes te transformeer vanaf kartering van populasie 18SC12. Ons het twee tot ses klone fenotipeer van elk van vyf onafhanklike transgenes afkomstig van SI genotipe B666, en drie transgenes afkomstig van die SI genotipe B667.
Klone van ses onafhanklike transgenies stel bessies geredelik by selfbestuiwing (Aanvullende Data 3). Daarbenewens het fluoressensiemikroskopie getoon dat stuifmeel van SLI transgeniese plante groei dieper in selfstyle as ongetransformeerde kontroles (Fig. 3b, c). Ons het stuifmeelbuisgroei in 442 selfbestuiwings in SLI transgenika en 179 selfbestuiwings in ongetransformeerde kontroles op 'n 0-4 skaal. Die meerderheid stuifmeelbuise het die eierstokke in die meeste bereik SLI transgene, in vergelyking met slegs 'n baie klein fraksie van die kontroles, wat aandui dat PGSC0003DMG400016861 die SLI geen.
Vervolgens het ons 'n CRISPR-Cas9-konstruksie ontwerp wat vir vier gRNA's kodeer wat op die eerste ekson van PGSC0003DMG400016861 gerig is (pAGM:CRISPRASli, Fig. 3a). Ons het twee SC genotipes (B665 & B663) met hierdie konstruk getransformeer en 149 getransformeerde regenerante verkry. Ons het toe die geteikende ekson ontleed deur PAGE te gebruik om CRISPR-Cas9-geïnduseerde INDEL's te identifiseer. Ongelukkig het die pAGM:CRISPRASli vektor 'n lae doeltreffendheid gehad, slegs ses van die 149 regenerante het INDEL's in SLI (Fig. 3d). Vyf van hierdie CRISPR-Cas9-lyne is heterosigoties vir die INDEL's, maar een lyn, B665ASli-2, is homosigoties vir 'n klein INDEL. Terwyl ongetransformeerde B665 maklik selfbessies stel en goeie selfstuifmeelbuisgroei toon deur 105 waargenome style, stel B665ASli-2 nie bessies by selfbestuiwing nie en sy stuifmeel is nie in staat om deur 78 waargenome style te groei nie (Fig. 3b, c en aanvullende data 3), wat verdere bewys lewer dat PGSC0003DMG400016861 wel die SLI geen.
In S-RNase-gebaseerde gametofitiese self-onversoenbaarheidstelsels word selfbevrugting verhoed deur stamper-uitgedrukte S-RNases wat stuifmeelbuise binnedring en sitotoksiese effekte uitoefen op selfstuifmeel of enige ander stuifmeel wat nie 'n bypassende S-Locus F-boks (SLF) het nie. ) proteïen. Kruisbevrugting word moontlik gemaak deur stuifmeel-uitgedrukte SLF-proteïene wat nie-self S-RNases kan herken en ontgift. Elke S-alleel kodeer verskeie SLF'e wat elkeen 'n ander S-RNase kan herken, en saam die meeste S-RNases teenwoordig in aartappel kan herken, behalwe die S-RNase wat op dieselfde S-alleel gekodeer is. Sli kodeer 'n F-boks proteïen PP2-B10, wat bestaan uit 'n F-boks domein gekoppel aan 'n lektien domein. Dit is bekend dat lektiendomeine met koolhidrate in wisselwerking kan tree, en kan moontlik met geglikosileerde proteïene in wisselwerking tree16. Verder is getoon dat S-RNases geglikosileer is17. Ons veronderstel dat die 533 bp-insersie in die promotor van die SC-alleel van Sli uitdrukking in stuifmeel moontlik maak, waar Sli in staat is om self S-RNases te bind en te ontgift, wat lei tot verlies van self-stuifmeelbuisgroeistop en dus selfversoenbaarheid. 'n Gedetailleerde ondersoek na MITE-aktiwiteit in aartappels deur Laimbeer het bevind dat 2% van MITE-invoegings naby genetiese streke geassosieer is met veranderinge in geenuitdrukking.
Verder, uit 1935 getoetste hAT-invoegings naby genetiese streke, het 13 gelei tot opregulering van die geassosieerde geen, wat aandui dat die veranderde stuifmeelspesifieke uitdrukking van SLI kan inderdaad veroorsaak word deur die 533 bp-invoeging in sy promotor18. Nogtans is verdere navorsing nodig om die geldigheid van hierdie hipotese te bepaal.
Voorheen het Clot et al 'n grootmaat segregante K-mer kartering benadering gebruik om 'n 333 kb interval op chromosoom 12 te identifiseer waarin Sli geleë moet wees19. Hier het ons die Sli-lokus na dieselfde streek van chromosoom 12 in 'n F1-populasie gekarteer en 'n rekombinante sifting gebruik om die interval te verminder na 12.6 KB wat 2 gene bevat. Uitdrukking analise het aan die lig gebring dat die SC alleel van een van hierdie gene spesifiek uitgedruk word in stuifmeel van SC genotipes. Ten slotte, met behulp van transgeniese uitdrukking en CRISPR-Cas9-geïnduseerde knock-out, toon ons afdoende dat PGSC0003DMG400016861 Sli is. Terwyl die studie deur Laimbeer getoon het dat MITE's nabygeleë gene op 'n weefselspesifieke wyse kan opreguleer, is meer navorsing nodig om te bewys dat die teenwoordigheid van die MITE in die Sli-promotor die oorsaak van sy stuifmeelspesifieke uitdrukking is.
In die materiaal wat in hierdie studie ondersoek is (Aanvullende Data 4), kon ons nie vroeëre verslae bevestig van dodelikheid wat verband hou met homosigositeit vir Sli nie, aangesien ons lewensvatbare F2-plante homosigoties vir Sli gevind het wat in staat was om bessies te stel (Aanvullende Data 1)12>20. Daarbenewens toon die genoomvolgordes van die ingeteelde lyn Solyntus, sowel as die ingeteelde lyn M6, dat beide hierdie lyne homosigoties is vir Sli, wat daarop dui dat homosigositeit vir Sli self nie dodelik is nie, alhoewel dit steeds moontlik is dat 'n dodelike alleel wat geneties gekoppel is aan Sli in 'n voorouer is verwyder deur rekombinasie in hierdie genotipes21"22. Uit die data wat in hierdie studie gegenereer is, kan ons egter nie die moontlikheid uitsluit dat die segregasievervorming wat in die F2-populasie waargeneem word, veroorsaak word deur 'n dodelike alleel wat in fase gekoppel is aan die SI-alleel van Sli nie. Tot dusver is dit onduidelik of Sli self S-RNases direk kan herken en ontgift. Verder is dit nie duidelik of Sli tot selfversoenbaarheid in alle S-lokus genotipes lei nie. Dit is moontlik dat die funksie van sommige S-allele nie deur Sli geïnhibeer kan word nie. Verdere navorsing is nodig om hierdie vraag op te los.
Terwyl die identifikasie van Sli verder ingeteelde-lyn-gebaseerde basterteling met diploïede aartappel moontlik maak, bly ander struikelblokke oor. Eerstens, die belangrikste, ly diploïede aartappel aan inteling depressie, wat lei tot verminderde groeikragtigheid en vrugbaarheid by inteling. Die suiwering van skadelike allele deur voortgesette selfbevrugting van diploïede aartappellyne is 'n doeltreffende metode om inteling depressie te verminder en het reeds gelei tot die generering van betreklik kragtige en vrugbare aartappel ingeteelde lyne2"23-25. Tweedens, die skenker van Sli wat in hierdie studie gebruik is, DS, is afgelei van 'n S. chacoense toetreding, wat moontlik lei tot probleme met die koppeling van skadelike allele van S. chacoense. In die diploïede teelprogram van Solynta sien ons nie oënskynlike probleme as gevolg van skadelike allele wat van S. chacoense af kom nie. Boonop het 'n onlangse studie oor selfversoenbaarheid aan die lig gebring dat SC-spesifieke k-mere reeds in verskeie tetraploïede kultivars teenwoordig is, wat 'n roete bied om hierdie potensiële koppelingsweerstand heeltemal te omseil deur dihaploïede wat uit hierdie kultivars gegenereer word as Sli-skenkers te gebruik19.
Metodes
Plantmateriaal. Alle gebruikte plantmateriaal word in Aanvullende Data 4 gelys
Kweekhuistoestande. Alle plante is in kweekhuise gekweek wat verhit is wanneer die temperatuur onder 14 °C gedaal het en afgekoel is deur die vensters oop te maak wanneer die temperatuur bo 19 °C toegeneem het. Kunsmatige beligting het die natuurlike lig aangevul toe die ligintensiteit onder 85 W/M2 gedaal het. Plante is gekweek in 'n spesiale aartappelsubstraatmengsel van Lentse Potgrond (Lentse Potgrond BV, Katwijk, Nederland). Die substraatmengsel wat gebruik word, is saamgestel uit 'n turfmengsel vir gebalanseerde wateropname, basiese stadigvrystellende kunsmis en kalk om die vereiste pH-vlak te verseker. Die substraatmengsel is bemes met 'n 20:20:20 Stikstof: Fosfor:Kalium oplossing met 'n elektriese geleidingsvermoë (EC) van 1.5.
Evaluering van selfversoenbaarheid. Blomme en knoppe is een keer per week getel en groeikragtigheid is een keer per maand op 'n skaal van 1 tot 9 beoordeel met 1 as 'n uiters nie-kragtige plant, en 9 is 'n uiters lewenskragtige plant. Stuifmeel van veelvuldige blomme van een plant is in 'n Eppendorf-buis versamel en dadelik gebruik vir selfbestuiwing op dieselfde blomme met 'n maksimum van 10 blomme per plant per week. Plante wat meer as twee selfbessies stel wat ten minste 35 sade per selfbessie bevat, is as selfversoenbaar geklassifiseer. Om vroulike vrugbaarheid te bepaal, is plante bestuif met opgehoopte stuifmeel van ten minste drie onverwante genotipes. Plante wat na ten minste 10 selfbestuiwings nie selfbessies gesit het nie, maar wel ten minste een grootmaatbessie gesit het en vrugbare stuifmeel in mikroskopiese ontleding van selfbestuiwe style getoon het, is as selfonversoenbaar geklassifiseer. Vir 40 genotipes van die karteringpopulasies waarin die bessie- en saadsetdata onoortuigend was (17SC11: n = 14, 18SC11: n = 7, 18SC12: n = 19), is fenotipiese klassifikasie gebaseer op selfstuifmeelbuisgroei deur die style (aangeken in Aanvullende Data 1).
Styl beelding. Om stuifmeelbuisgroei te visualiseer, is bestuifstyle 24-48 uur na bestuiwing verwyder en dan vir ten minste 3 uur in 1:24 etanol:asynsuur gefixeer. Die style is dan vir 8 min by 10 °C in 65M NaOH gemasereer en twee keer met gedeïoniseerde water gespoel. Styles is op mikroskopieskyfies geplaas en vir 2-5 minute gekleur met 0.1% Anilienblou (Carl Roth GmbH) in 0.1MK4P2O7 (pH = 7), dan in gliserol fyngedruk met 'n dekstrokie en waargeneem met 'n Zeiss Axiolab-fluoressensiemikroskoop met behulp van 'n filterstel 01 (BP 365/12, FT 395 en LP 397). Alle style is waargeneem en beoordeel deur gebruik te maak van twee parameters: (1) diepste penetrasie in die styl, soos uitgedruk in persentasie van maksimum penetrasie, (2) % van stuifmeelbuise wat die diepste penetrasie bereik. Ons het toe hierdie persentasies omgeskakel na 'n 0-4 skaal, waar style waarin geen stuifmeelbuise die eierstok bereik het 'n telling van 0 gekry het nie, style waarin tussen 0 en 25% van stuifmeelbuise 'n telling van 1 gekry het, style waarin tussen 25 en 50% van stuifmeelbuise het die eierstok bereik het 'n telling van 2 gekry, style waarin tussen 50 en 75% van stuifmeelbuise die eierstok bereik het 'n telling van 3 gekry, en style waarin meer as 75% van stuifmeelbuise die eierstok bereik het 'n telling van 4.
Beeldverwerwing. Geselekteerde style is afgebeeld met behulp van 'n Zeiss Axiophot-mikroskoop met filterstel 01, met behulp van 'n Zeiss AxioCam ICc 5. Die beelde is gemaak met behulp van die Zeiss Zen 2.3 (blou uitgawe) sagtewarepakket. Tydens verkryging is die instellings aangepas om agtergrond te minimaliseer. Styles is afgebeeld met behulp van die x5-doelwit en is gestoor as TIFF-lêers met 'n resolusie van 2464 x 2056 piksels met 24-bis diepte. Tot agt afsonderlike beelde is dan saamgestel met behulp van Panavue beeldversamelaar. Die kontras en helderheid van die saamgestelde style is aangepas om Fig. 1a en 3c.
DNA onttrekking. Vir KASP-analise van die kartering van populasies is blaarmonsters na VHLGenetics (Wageningen, Nederland) gestuur vir DNA-ekstraksie deur gebruik te maak van sbeadex™-stelle (LGC Genomics GmbH, Berlyn, Duitsland) volgens die protokol wat deur die vervaardiger verskaf is.
KASP analise. Mededingende alleel-spesifieke PCR (KASP™)-analise is uitgevoer deur VHLGenetics (Wageningen, Nederland) met behulp van KASP-toetse wat ontwerp is om spesifiek te wees vir SNP's wat in ons materiaal segregeer. KASP-toetse is uitgevoer volgens die protokol verskaf deur die vervaardiger (LGC Genomics GmbH, Berlyn, Duitsland). Die resultate van die KASP-toetse is gevisualiseer met behulp van SNPviewer (beskikbaar by lgcgroup.com/products/genotyping-software/snpviewer) om korrekte segregasie en genotipe-roeping te bevestig.
Koppelingsanalise. Haplotipes van selfversoenbare vroulike ouers is gerekonstrueer uit die genotipe data deur rekombinasietempo's tussen verskillende SNP's te analiseer. Hierdie data is gebruik om die SNP-oproepe in 'n "axb"-formaat om te skakel, waarin die "a"-haplotipe gekoppel is aan die selfversoenbare alleel van Sli, terwyl die "b"-haplotipe aan 'n selfonversoenbare alleel van Sli gekoppel is. Koppelingskaarte is geskep met behulp van Joinmap 4.126 met bevolkingstipe DH en verstekinstellings.
QTL-kartering. Die fenotipe data is omgeskakel na 'n numeriese eienskap deur 1 toe te ken aan elke self-versoenbare genotipe, 0 aan elke self-onversoenbare genotipe, en * aan genotipes waarvoor versoenbaarheid nie bepaal kon word nie. QTL kartering is uitgevoer met behulp van interval kartering in MapQTL27. Die uitsette van MapQTL is gebruik om QTL-plotte met Mapchart 2.3 te genereer28.
Bioinformatiese analise. Om korrekte geenmodelle in die aanvanklike 27.37 kb interval te identifiseer, het ons twee afsonderlike geenaantekeninge vir die DM4.04 verwysingsgenoom, die PGSC annotasie en die ITAG annotasie ondersoek. Sien ook Hirsch et al.29. Om die korrektheid van die aantekeninge te bevestig, het ons BLASTp-soektogte uitgevoer met die voorspelde proteïenvolgorde van beide aantekeninge. Deur die beste treffers in die BLASTp-soektog met ons navraag te vergelyk, het ons vasgestel of alle geannoteerde eksons en domeine in die voorspelde proteïenvolgorde deur soortgelyke proteïene in aartappel- en ander plantspesies ondersteun is. Verder, publiek beskikbare RNA-volgorde-biblioteke op SPUD DB (beskikbaar by solanaceae.plantbiology.msu.edu/cgi-bin/ gbrowse/potato/) en NCBI genoomdatakyker (beskikbaar by ncbi.nlm.nih.gov/ genome/gdv /browser/) is gebruik om te bepaal of vermeende eksons uitdrukkingsbewyse het. Saam het hierdie twee benaderings ons in staat gestel om die intron-ekson strukture van die geenmodelle in beide aantekeninge te bekragtig, wat gelei het tot 'n ingeligte keuse vir een of meer isovorme van geenmodelle om die betrokke geen voor te stel. Gebaseer op hierdie benaderings, is kandidaatgeen PGSC0003DMG400016862 erken as waarskynlik gedeeltelik en onbeduidend uitgedruk en van verdere ontledings weggegooi. Die geenmodel Sotub12g029970 is as korrek beskou, terwyl sy PGSC-eweknie PGSC0003DMG400016860 waarskynlik afgekap is. Omdat dit grootliks buite die aangewese interval geleë is, en geen relevante aminosuurvervangings tussen SC- en SI-plante geïdentifiseer kon word nie, is hierdie geen van verdere ontledings weggegooi.
Variasie-analise. Om mutasies in die 27.37 kb-interval wat spesifiek is vir selfversoenbare genotipes te identifiseer, is alle hoë-vertroue SNP's (Aanvullende Data 3) bepaal wat (1) homosigoties was in DS, 17SC100-18 en 17SC100-2 (omdat al drie homosigoties is vir die SC alleel van Sli (Sli/Sli')'), (2) homosigoties verskil in D16 (omdat D16 homosigoties is vir die SI-alleel van Sli (sli/sli)), en (3) heterosigoties in beide 16HP1-66 en 17SC25-8 (omdat albei heterosigoties is vir SC-alleel Sli (Sli) /sli)). Die alleliese volgorde is verkry deur de novo-samestelling met SPAdes weergawe 3.11.130 van 150 nt gepaarde-end Illumina-data van die bogenoemde plante (van ongeveer 25-30X volgorde-diepte). Gevolglike contigs is in lyn gebring met die DM-verwysing (met gebruik van minimap2 weergawe 2.1) en gefiltreer vir diegene wat betroubaar in lyn is met die 27 kb. Uit hierdie belynde contigs is variasie relatief tot DM4.03 eenvoudig gekwantifiseer (met behulp van die subroetines mpileup en oproep van bcftools, weergawe 1.9) en gelys in die Variant Call Format (VCF).
Aminosuur verandering analise. Uit hierdie lys van SC-spesifieke mutasies is alle nie-sinonieme SNP's geïdentifiseer deur oorvleueling met die aangewese koderende eksons. Die aminosuurveranderinge relatief tot óf DM óf SI volgorde is gelys. Unieke aminosuurveranderinge is geïdentifiseer deur BLASTp-soektogte deur die proteïenvolgorde uit te voer en veelvuldige volgordebelyning uit te voer deur die top 100 BLASTp-treffers te gebruik.
Variasie in promotor- en terminatorstreke. Die promotorstreek is gekies om die volgorde stroomop van die beginkodon te wees tot die koderingsvolgorde van die stroomopgeen met 'n maksimum van 1500 nt. Dramatiese variasie in promotorstreke is gevind binne die 27.37 kb interval, waarvan die opvallendste verskeie groter delesies en invoegings van tiene tot honderde nukleotiede lank was. Alle variasie in die Sli-interval, relatief tot DM, is verkry, insluitend dié van die promotor/stroomopstreek sowel as die terminator/stroomafstreek.
Stuifmeel verkryging en ontkieming. Stuifmeel van die genotipes wat in Fig. 2a is verkry deur oop blomme te vibreer met 'n elektroniese tandeborsel en die stuifmeel in 1.5 ml Eppendorf-buise te versamel. Na die verkryging is die stuifmeel gedroog deur die oop Eppendorf-buise met stuifmeel in 'n lugverseëlde boks met silikagel vir 24 uur by kamertemperatuur te stoor. Daarna is die stuifmeel by -20 °C gestoor tot verdere gebruik.
Stuifmeel is ontkiem deur 2.5 mg gedroogde stuifmeel te suspendeer in 5 ml vloeibare medium (9% (w/v) sukrose, 50 mg/l boorsuur, 73.5 mg/l CaCly2H2O, 118 mg/l Ca (NO3) 24H2O, 123 mg/l MgSO.4VH2O) in 3.5 cm deursnee Petri-skottels wat met parafilm verseël is. Die stuifmeel is gelaat om te ontkiem in die Petri-skottels vir 24 uur in die donker in 'n skud-broeikas by kamertemperatuur en geskud teen 125 RPM. Die vloeibare medium wat die ontkiemde stuifmeel bevat, is dan versigtig in 2 ml Eppendorf-buise gepipetteer deur gebruik te maak van pipetpunte wat aangepas is om die openinggrootte te vergroot om nie die stuifmeelbuise te beskadig nie. Die Eppendorf-buise is dan vir 600 min by 1xg gesentrifugeer en die medium is versigtig deur pipet verwyder. Die korrel en van die oorblywende medium is dan dadelik in vloeibare stikstof gevries, twee vlekvrye staal krale (2 mm deursnee) is bygevoeg en die monsters is gemaal met 'n TissueLyser II (Qiagen GmbH, Hilden, Duitsland) by 20 Hz vir 1 min.
RNA-ekstraksie en volgordebepaling. Buffer RLT (Qiagen GmbH) is by die gemaalde stuifmeelmonsters gevoeg terwyl seker gemaak is dat die monsters gevries bly. RNA-ekstraksie is dan uitgevoer met behulp van die RNeasy-ministel volgens die vervaardiger se protokol (Qiagen GmbH, Hilden, Duitsland). Die 250-300 bp-insetselgrootte cDNA-biblioteke is as 150nt-gepaarde-end-lesings opgevolg, wat 30-42 miljoen leespare per monster oplewer (Novogene, Cambridge, Verenigde Koninkryk).
Ander RNA-volg datastelle. Om 'n oorsig van (weefselspesifieke) uitdrukkingsvlakke te skep, is alle gepaarde-end-volgorde-RNA-volgorde-datastelle gemerk as ORGANISME "Sola-num tuberosum" is afgelaai vanaf die publieke domein (NCBI-SRA, datum 2018/17/13), altesaam 441 gepaarde fastq-datastelle. Uit hierdie 441 publieke datastelle is 3 gegenereer uit stylweefsel (SRR7402817-SRR7402819) en alle ander uit verskeie nie-stuifmeelweefsels, ontwikkelingstadia en plantegroei.
Solyntus verwysingssamestelling. Vir uitdrukkingsontledings, die onlangs verkrygde konsepsamestelling van homosigotiese verwysingslyn Solyntus (weergawe 1.0, aflaaibaar by www.plantbreeding.wur.nl/Solyntus/) is as 'n verwysingsgenoom gebruik. Solyntus is 'n wesenlik homosigotiese variëteit wat as deel van die teelprogram van Solynta gegenereer word21. Die kartering intervalle in hierdie studie is afgelei van die DM v4.03 genoom samestelling31 na die Solyntus 1.0-genoomsamestelling deur basiese ooreenkomstesoektogte (met BLASTn en bedgereedskap) om geleë te wees by (Solyntus 1.0-genoomsamestellingkoördinate) 53532708-53954293 (Interval I, 421.6kb < —628.9kb, 53683239 (Interval 53867377, 184.1 (Interval 168.7) 53731620 (Interval) kb< — 53763003kb), 31.4-27.4 (Interval III, 53753977kb< —53763003kb) en 9.0-12.6 (Interval IV, 1.0kb < —1.0 kb), onderskeidelik. Tussen hakies is die opeenvolgende kartering-intervalnommer [Solyntus 4.03-koördinate], grootte in Solyntus-4.04, en grootte in DM-4.03/12, onderskeidelik. Alle intervalle is op chromosoom ST12ch1.0_RaGOO (synde chromosoom 4.03) geleë en bevat nie 'n enkele gaping in die Solyntus 4.04-samestelling nie. Intervalgroottevariasie word veroorsaak deur 'n veelheid gapings (N'e) in die ooreenstemmende DM-volgorde en uitgebreide variasie tussen beide genome. Ooreenstemmende intervalle op DM-genoom (DM-12/58601503): Interval I: chr59230363:12-58962004, Interval II: chr59130723:59016142-59043512; Interval III: 12-59030880; Interval IV: chr59043512:XNUMX-XNUMX.
Geenannotasie op Solyntus 1.0 is afgelei uit drie afsonderlike geenkatalogusse (aartappel DM4.03, ITAG4.0 Tamatie Genoom Annotasievrystelling van 6 Sep 201932, en Pepper-v. 1.5533), wat op die Solytus-samestelling gekarteer is deur GeMoMa (v1.6.1) te gebruik. Dit is gedoen om te vergoed vir onvolmaakthede in individuele geenkatalogusse en om ons bewustheid van die bestaan van moontlike gene en/of uitgedrukte lokusse te maksimeer.
RNA-volgorde lees-kartering en transkripsie oorvloed kwantifikatioon. Al 5 SC, 3 SI en al 441 publieke RNA-volg datastelle is gekarteer na die Solyntus verwysingsgenoom met behulp van hisat2 (weergawe 2.1.0). Die hibriede geenkatalogus wat met GeMoMa verkry is, is gebruik vir transkripsie-geleide oorvloed skatting deur gebruik te maak van StringTie (weergawe 2.1.1) met instellings -t -c 5 -f 0.05 -G en 'n GeMoMa aaneengeskakelde Solyntus1.0 gff lêer. Alle waargenome uitdrukking in 'n 500 kb interval rondom die SLI lokus as 'n sentrum is geëvalueer, waarin 'n totaal van 90 (afgeleide) geen-lokusse geleë is. Ons het die afwesigheid van enige merkbare uitdrukking in SC-monsters buite enige van hierdie geen-lokusse bevestig. In die 500 kb-interval het ons die daaropvolgende kleiner aantal kandidate-gene aangedui wanneer dit met ons karteringsintervalle I-IV, soos hierbo gedefinieer, sny.
metfirmasie van haplotipe-spesific uitdrukking. Van 90 uitgedrukte lokusse in die 500 kb interval, is slegs 8 uitgedruk bo 'n geselekteerde drempel van 20 FPKM in al die SC/SI monsters. Ons het hierdie terreine gebruik om haplotipe-spesifieke (Sli of sli) uitdrukkingsvlakverskille te meet. Die geselekteerde uitdrukkingsdrempel het voldoende leesdiepte moontlik gemaak om die uitdrukking uiteindelik en betroubaar in (hoogstens) 2 haplotipes te faseer. Saam met die PSC-lokus self (wat nie uitdrukking in SI-plante het nie), is hierdie 8 + 1 lokusse in elk van die 8 monsters gehaplotipeer (SAMtools fase weergawe 1.7, verstek instellings). Die gevolglike haplotipe (gepaarde) fastq-lêers is de novo saamgestel deur gebruik te maak van SPAdes (weergawe 3.11.1). Die gevolglike kontigs is gefiltreer vir ruim oorvloed en vermoedelik vollengte mRNA's, wat ooreenstem met die hoof (haplotipe) uitgedrukte isovorm. In sommige gevalle het dit alternatiewelik gesplitste isovorme verwyder, waarvan nie een deur voldoende leeswerk ondersteun is om van enige ooglopende biologiese belang te wees nie. Die variasie in hierdie haplotipe mRNA-volgordes is gebruik om te (dis)bevestig of een of albei haplotipes in elk van die ooreenstemmende lokusse/monsters uitgedruk is.
Ontwerp van SLI uitdrukkingskonstruksie. Ons het die volgorde van die Sli-skenkerplant DS gebruik om die Sli-uitdrukkingkasset te ontwerp. Om inheemse uitdrukking van toe te laat PSC, ons het 'n nukleïensuurvolgorde gekonstrueer wat die inheemse promotor (1563 bp stroomop van die beginkodon), die drie eksons en die inheemse terminator (740 bp stroomaf van stopkodon) bevat. So, beide introne is verwyder uit die PSC geen van skenkerplant DS. Hierdie volgorde is gesintetiseer en in pBINPLUS gekloneer deur Genscript (Genscript Biotech, Leiden, Nederland). Ons verwys na die vektor wat die SLI voeg as pBINPLUS-Sli in.
Konstruksie van CRISPR-Cas9 vektor. Ons het vier gRNA's ontwerp gebaseer op die volgorde van PGSC0003DMG400016861 in DM4.03 in plekke waar geen variasie tussen die SC en SI allele teenwoordig was nie. Vir die keuse van geskikte gidse en konstruksie van die vektor, het ons die metode gebruik wat deur Santillan Martinez et al.34. Kortliks, vier sgRNA's is gekies volgens die riglyne beskryf deur Liang et al.35. Die CC-Top CRISPR/Cas9 teikenvoorspellingsinstrument is gebruik om 'n lys sgRNA's te genereer36, vou is geassesseer met behulp van die Mfold-webbediener37, en aktiwiteit van die sgRNA's is voorspel deur die sgRNA-telling te gebruik38. Die volgende gidse is geselekteer en gebruik om die vektor pAGM:CRISPRASli te konstrueer: exon5.1T01 (ATTTCATCCGCGATCTCTCGGGG), exon5.1T04 (GATTTCA TCCGCGATCTCTCGGG), exon5.1T06 (TATTTCCTATTGCTACCAGAAGG), en exon5.1CTCTTCGGCCG (TATTTCCTATTGCTACCAGAAGG) en exon07CTCTCTCCCCG. Die CRISPR-konstruksie is toe gesintetiseer deur gebruik te maak van plasmiede verkry vanaf Addgene: pICH86966 (sjabloon vir amplifikasie); pICSL01009 (vlak 0 plasmied); pICH47751, pICH47761, pICH47772, pICH47781 en pICH47732 (vlak 1 plasmiede); pICH41822 (skakelaar vir vier gidse); en pAGM4723 (vlak 2 binêre vektor). Die plasmied is gekloon met behulp van E. coli DH5a en gesuiwerde plasmied is gestuur vir volgordebepaling deur gebruik te maak van primers PDS5843 (TTTGTGATGCTCGTCAGGGG), PDS8535 (CCCGAGAATTATGCAGCATT TT) PDS8536 (TCATCAGTCAATTACGGGGCT), en AL717 (GCTTGGCATC komponente) om die teenwoordigheid en korrekte oriëntasie van AGACAANPg TI te bevestig, (CASTTGGACATC TI, en Cas-oriëntasie).
Transformasie van pBINPLUS-Sli en die pAGMzCRISPRASli vektor in Agrobacterium tumefaciens. Ons het pBINPLUS-Sli omskep in A. tumefaciens stam AGL0 en pAGM:CRISPRASli in A. tumefaciens stamme AGL0 en AGL1 deur 'n elektroporasieprotokol te gebruik. Ons het 40 pl bekwame AGL0-selle geneem en 110 pl yskoue milliQ-water bygevoeg. Ons het 50 pl van hierdie mengsel in voorafverkoelde Eppendorf-buise op ys gepipetteer en 1 pl van die plasmied bygevoeg. Ons het die selle vir 15 min op ys gelaat en die selle oorgeplaas na voorafverkoelde elektroporasiekuvette. Ons het die mengsels geëlektroporeer met 'n Micropulser™ (Bio-Rad Laboratories, Vee-nendaal, Nederland) deur die program Ec1 (1.8 kV, 0.1 cm kuvette) te gebruik. Ons het 1 ml LB bygevoeg en die selle vir 3 uur op 'n skudder by 28 °C en 200 RPM geïnkubeer. Daarna het ons LB-agarplate wat Rifampicin (100 pg/ml) en Kanamycin (50 pg/ml) bevat, met die transformasiekultuur ingeënt. Daar is bevestig dat alle uitgesoekte kolonies die korrekte vektor bevat.
Transformasie van aartappelgenotipes. Ons het genotipes B666 en B667 getransformeer met pBINPLUS-Sli en genotipes B663 en B665 met pAGM:CRISPRASli vektor deur gebruik te maak van die stamuitplantingsmetode wat deur Visser beskryf is39. Kortliks, internode uitplantings is verkry van in vitro gekweekte genotipes en is op Petri-skottels wat R3B-medium bevat het met 2 ml PACM-medium geplaas. Die volgende dag, 50 ml van 48 h Agrobacterium kulture is gesentrifugeer en hersuspendeer in 75 ml LB. Die internode-eksplantings is toe in die Agrobacterium suspensie vir 5 min, gedroog op die filter, en terug geplaas op die Petri-skottels wat R3B-medium bevat. Na 48 uur se inkubasie is die uitplantings oorgeplaas na Petri-skottels wat MS20 bevat met antibiotika en in 'n groeikamer geplaas om regenerasie van lote moontlik te maak. Na regenerasie is die lote op MS20 media gekweek wat sefotaksim (200 pg/ml), vankomisien (200 pg/ml) en kanamisien (100 pg/ml) bevat het. Wanneer die lote voldoende lengte bereik het, is steggies gemaak en sonder antibiotika in MS20 gekweek. Na minstens twee weke se groei op MS20 sonder antibiotika, is die plante in die kweekhuis geplant.
Ploïdie analise. Die ploïdie van transgeniese plante sowel as die nie-getransformeerde kontroles is met behulp van vloeisitometrie deur Plant Cytometry Services (Didam, Nederland) bepaal. Alle tetraploïede regenerante is weggegooi.
BLADSY analise van CRISPR-Cas9-geïnduseerde mutasies. DNS-ekstraksie, PCR en PAGE-analise is deur Limgroup (Horst, Nederland) uitgevoer. Die volgende primers is gebruik om die CRISPR-Cas9-geteikende streek te versterk: Voorwaartse primer: CTATTTCCTATTGCTACCAG, omgekeerde primer: AAACTTTACCCAAAT AACGTC. Etikettering van die PCR-produkte is verkry deur 'n omgekeerde primer met 'n M13 stert (primervolgorde: TGTAAAACGACGGCCAGTAAACTTTAC CCAAATAACGTC) en óf 700 IRDye óf 800 IRDye gemerkte M13 primer by die PCR mengsel by te voeg. Die resulterende PCR-produkte is op PAGE ontleed deur 'n Li-cor-stelsel te gebruik. PCR-produkte van die meeste van die lyne sonder CRISPR-Cas9-geïnduseerde mutasies is uit die jelbeelde gesny om Fig. 3d (uitsnydings aangedui deur stippellyne).
Filogenetiese analise van die 533 bp invoeging. Die volgorde van die 533 bp invoeging is ontleed met behulp van BLASTn op die NCBI webwerf. Die beste 30 treffers, insluitend die invoeging teenwoordig in SLI in Solyntus, is dan afgelaai en belyn in MegAlign Pro 17 (DNASTAR) deur gebruik te maak van MUSCLE met verstekinstellings. Die bome is gegenereer deur gebruik te maak van die algoritme vir aansluiting by buurman met verstekinstellings.
Verslagopsomming. Verdere inligting oor navorsingsontwerp is beskikbaar in die Nature Research Reporting Summary gekoppel aan hierdie artikel.
Data beskikbaarheid
Die Solyntus-genoomvolgorde en rou volgordelesings is beskikbaar op NCBI onder toetreding PRJNA631911. Die Solyntus-genoomsamestelling en annotasielêers is beskikbaar by WUR [https://www.plantbreeding.wur.nl/Solyntus/]. Die RNA-volgordedata van ontkiemde stuifmeel is beskikbaar op die NCBI-kortleesargief onder toetreding PRJNA713577. Ander data is beskikbaar in die brondatalêer of sal op versoek beskikbaar gestel word. Brondata word saam met hierdie vraestel verskaf.
Ontvang: 22 Januarie 2021; Aanvaar: 8 Junie 2021;
Gepubliseer aanlyn: 06 July 2021
Verwysings
- 1. Duvick, DN Die bydrae van teling tot opbrengsvooruitgang in mielies (Zea) mays L.). Adv. Agron. 86, 83-145 (2005).
- 2. Lindhout, P. et al. Op pad na F1 bastermoere teling. Aartappel Res. 54, 301-312 (2011).
- 3. Jansky, SH et al. Herontdek aartappel as 'n diploïede ingeteelde lyngebaseerde gewas. Crop Sci. 56, 1412-1422 (2016).
- 4. Julle, M. et al. Generasie van selfversoenbare diploïede aartappel deur uitklop van S-RNase. Nat. Plante 4, 651-654 (2018).
- 5. Enciso-Rodriguez, F. et al. Oorkom self-onversoenbaarheid in diploïede aartappels deur CRISPR-cas9 te gebruik. Voorkant. Plant Sci. 10, 1-12 (2019).
- 6. Su, Y. et al. Introgressie van gene vir weerstand teen Phytophthora infestans in diploïede aartappel. Am. J. Aartappel Res. 97, 33-42 (2020).
- 7. Dzidzienyo, DK, Bryan, GJ, Wilde, G. & Robbins, TP Alleliese diversiteit van S-RNase-allele in diploïede aartappelspesies. Teore. Appl. Genet. 129, 1985-2001 (2016).
- 8. McClure, B., Cruz-Garcia, F. & Romero, C. Verenigbaarheid en onversoenbaarheid in S-RNase-gebaseerde stelsels. Ann. Bot. 108, 647-658 (2011).
- 9. Kubo, K. et al. Samewerkende nie-selfherkenningstelsel in S-RNase-gebaseerde selfonversoenbaarheid. Wetenskap 330, 796-799 (2010).
- 10. De Jong, H. & Rowe, PR Inteling in gekweekte diploïede aartappels. Aartappel Res. 14, 74-83 (1971).
- 11. Hermsen, JGT & Olsder, J. Genetika van selfversoenbaarheid in dihaploïede van Solanum tuberosum L. 1. Teelgedrag van twee selfversoenbare dihaploïede. Euphytica 25, 597-607 (1976).
- 12. Hosaka, K. & Hanneman, RE Jr. Genetika van selfversoenbaarheid in 'n selfonversoenbare wilde diploïede aartappelspesie Solanum chacoense. 1. Opsporing van 'n S lokus inhibeerder (Sli) geen. Euphytica 99, 191-197 (1998).
- 13. Hosaka, K. & Hanneman, RE Jr. Genetika van selfversoenbaarheid in 'n selfonversoenbare wilde diploïede aartappelspesie Solanum chacoense. 2. Lokalisering van 'n S lokus inhibeerder (Sli) geen op die aartappel genoom deur gebruik te maak van DNS merkers. Euphytica 103, 265-271 (1998).
- 14. Birhman, RK & Hosaka, K. Produksie van ingeteelde nageslagte van diploïede aartappels deur gebruik te maak van 'n S-lokus inhibeerder (Sli) geen, en hul karakterisering. Genoom 502, 495-502 (2000).
- 15. Chen, J., Hu, Q., Zhang, Y., Lu, C. & Kuang, H. P-MITE: 'n databasis vir plant miniatuur omgekeerde-herhaal transponeerbare elemente. Nukleïensure Res. 42, 1176-1181 (2014).
- 16. Stefanowicz, K., Lannoo, N. & Van Damme, EJM Plant F-boks proteïene— oordeel tussen lewe en dood. Krit. Eerw Plant Sci. 34, 523-552 (2015).
- 17. Liu, B., Morse, D. & Cappadocia, M. Glykosilering van S-RNases kan stuifmeelverwerpingsdrempels in Solanum chacoense beïnvloed. J. Exp. Bot. 59, 545-552 (2008).
- 18. Laimbeer, FPE Aartappelgenomika op drie maniere: kwantifisering van endoreduplikasie in knolle, 'n gejaag deur die transposonterrein, en toeligting van blomkleurregulering. http://hdl.handle.net/10919/84480 (2018).
- 19. Clot, CR et al. Die oorsprong en wydverspreide voorkoms van Sli-gebaseerde selfversoenbaarheid in aartappels. Teore. Appl. Genet. https://doi.org/10.1007/s00122-020-03627-8 (2020).
- 20. Endelman, J., Jansky, SH, Butler, N. & Christensen, G. Genetiese bewyse van 'n resessiewe dodelike alleel op aartappelchromosoom 12-jaarverslag van die Aartappelvereniging van Amerika. Am. J. Aartappel Res. 96, 331 (2019).
- 21. van Lieshout, N. et al. Solyntus, die nuwe hoogs aaneenlopende verwysingsgenoom vir aartappel (Solanum tuberosum). G3 Gene Genome Genet. 10, 3489-3495 (2020).
- 22. Leisner, CP et al. Genoomvolgorde van M6, 'n diploïede ingeteelde kloon van die hoë-glikoalkaloïed-produserende knoldraende aartappelspesies Solanum chacoense, onthul oorblywende heterosigositeit. Plant J. 1967, 562-570 (2018).
- 23. Peterson, BA et al. Selfvrugbaarheid in 'n gekweekte diploïede aartappelpopulasie ondersoek met die infinium 8303 aartappel enkel-nukleotied polimorfisme skikking. Plantgenoom https://doi.org/10.3835/plantgenome2016.01.0003 (2016).
- 24. Lian, Q. et al. Verkryging van skadelike mutasies tydens aartappel poliploïdisering. J. Integr. Plant Biol. 61, 7-11 (2019).
- 25. van Lieshout, N. et al. Solyntus, die nuwe hoogs aaneenlopende verwysingsgenoom vir aartappels (Solanum tuberosum). G3 Gene Genome Genet. 631911, g3.401550.2020 (2020).
- 26. Van Ooijen, JW Sluit aan by Map®4, Sagteware vir die berekening van genetiese koppelingskaarte in eksperimentele populasies Vol. 33 (Kyazma BV, 2006).
- 27. van Ooijen, JW Akkuraatheid van kartering van kwantitatiewe eienskap loci in outogame spesies. Teore. Appl Genet. 84, 803-811 (1992).
- 28. Voorrips, RE Mapchart: sagteware vir die grafiese aanbieding van koppelingskaarte en QTL'e. J. Hered. 93, 77-78 (2002).
- 29. Hirsch, CD et al. Spud DB: 'n hulpbron vir mynvolgordes, genotipes en fenotipes om aartappelteling te versnel. Plantgenoom. 7, https://doi.org/ 10.3835/plantgenome2013.12.0042 (2014).
- 30. Bankevich, A. et al. SPAdes: 'n nuwe genoomsamestellingsalgoritme en die toepassings daarvan op enkelselvolgordebepaling. J. Rekenaar. Biol. 19, 455-477 (2012).
- 31. Sharma, SK et al. Konstruksie van verwysing chromosoomskaal pseudomolekules vir aartappel: integreer die aartappelgenoom met genetiese en fisiese kaarte. G3 Gene Genome Genet. 3, 2031-2047 (2013).
- 32. Fernandez-Pozo, N. et al. Die Sol Genomics Network (SGN) - van genotipe tot fenotipe tot teling. Nukleïensure Res. 43, D1036-D1041 (2015).
- 33. Kim, S. et al. Genoomvolgorde van die soetrissie bied insig in die evolusie van skerpheid in Capsicum spesies. Nat. Genet. 46, 270-278 (2014).
- 34. Santillan Martinez, MI et al. CRISPR/Cas9-geteikende mutagenese van die tamatie vatbaarheid geen PMR4 vir weerstand teen poeieragtige skimmel. BMC Plant Biol. 20, 1-13 (2020).
- 35. Liang, G., Zhang, H., Lou, D. & Yu, D. Seleksie van hoogs doeltreffende sgRNAs vir CRISPR/Cas9-gebaseerde plantgenoom redigering. Sci. Rep. 6, 1-8 (2016).
- 36. Stemmer, M., Thumberger, T., Del Sol Keyer, M., Wittbrodt, J. & Mateo, JL CCTop: 'n intuïtiewe, buigsame en betroubare CRISPR/Cas9-teikenvoorspellingsinstrument. PLoS ONE 10,1-11 (2015).
- 37. Zuker, M. Mfold webbediener vir nukleïensuur vou en hibridisasie voorspelling. Nukleïensure Res. 31, 3406-3415 (2003).
- 38. Chari, R., Yeo, NC, Chavez, A. & Church, GM SgRNA Scorer 2.0: 'n spesie-onafhanklike model om CRISPR/Cas9-aktiwiteit te voorspel. ACS Synth. Biol. 6, 902-904 (2017).
- 39. Visser, RGF in Handleiding vir plantweefselkultuur 301-309 (Springer, 1991).
Mededingende belange
Die outeurs verklaar geen mededingende belange nie.
Bykomende inligting
Aanvullende inligting Die aanlyn weergawe bevat aanvullende materiaal beskikbaar by https://doi.org/10.1038/s41467-021-24267-6.
korrespondensie en versoeke vir materiaal moet aan CWBB gerig word
Inligting oor ewekniebeoordeling Nature Kommunikasie bedank Roger Chetelat en die ander, anonieme beoordelaar(s) vir hul bydrae tot die portuurbeoordeling van hierdie werk. portuurbeoordelingsverslae is beskikbaar.
Herdrukke en toestemming inligting is beskikbaar by http://www.nature.com/reprints
uitgewer"se nota Springer Nature bly neutraal ten opsigte van jurisdiksie-eise in gepubliseerde kaarte en institusionele affiliasies.
Bedankings
Ons erken die hulp van Veronica Tammy Soputro in die transformasie van twee aartappelgenotipes met pAGM:CRISPRASli, die hulp van BSc- en MSc-studente Gilo Pleunis, Iris Smits, Niki Vorgia, Hidde Knuiman, Maurice Geurts, Anja van Heteren en Torsten van der Schriek vir hul hulp met die fenotipering van die kartering van populasies, en Tess Lucas vir die generering van RNA-monsters. Ons gee verder erkenning aan die Solynta- en Wageningen Universiteit Unifarm-kweekhuiswerknemers vir hul hulp met die instandhouding van die plante en saadonttrekking. Hierdie projek het finansiële ondersteuning ontvang van die Nederlandse Organisasie van Wetenskaplike Navorsing (Toekenning ID: NWA.17.023).
Skrywer bydraes
E.-JE het die eksperimente ontwerp en uitgevoer en die manuskrip geskryf. AvdB het die WGS-, KASP-merker- en bioinformatikabenaderings ontwerp en uitgevoer. SvH, RGFV, CWBB, MEdV en PL het gehelp om die benadering vir die genetiese karteringstudies en funksionele karakterisering van SLI. RGFV, CWBB en PL het die manuskrip hersien en kommentaar gelewer.
I(S) V) Open Access Hierdie artikel word gelisensieer onder 'n Creative Commons Erkenning 4.0 Internasionale lisensie, wat gebruik, deel, aanpassing, verspreiding en voortplanting in enige medium of formaat toelaat, solank u die nodige krediet aan die oorspronklike outeur (s) en die bron gee, skakel na die Creative Commons-lisensie, en dui aan of daar veranderinge aangebring is. Die beelde of ander derdeparty-materiaal in hierdie artikel is ingesluit in die Creative Commons-lisensie van die artikel, tensy anders aangedui in 'n kredietlyn vir die materiaal. As materiaal nie by die Creative Commons-lisensie van die artikel ingesluit is nie en u beoogde gebruik nie deur statutêre regulasie toegelaat word nie, of die toegelate gebruik daarvan oorskry, moet u toestemming direk van die kopiereghouer verkry. Besoek 'n kopie van hierdie lisensie http://creativecommons.org/ lisensies/by/4.0/.
Jy moet wees aangemeld om 'n kommentaar te kan lewer.